Western Blot 做相对定量，前提是内参稳定。但很多实验翻车，恰恰翻在内参选择上。选择内参，核心看三件事。
一看分子量避让。内参条带必须与目的蛋白分开。目的蛋白在 42 kDa 附近就避开 β-actin（约 42 kDa），在 37 kDa 附近避开 GAPDH，在 50~55 kDa 附近避开 α-Tubulin。这是最基本也最常被忽略的一条。
二看组织与细胞类型。β-actin 在骨骼肌、心肌组织中表达量高且可变；脂肪组织中 GAPDH 表达偏低。做这些组织样本时，需要换用表达更稳定的内参或改用总蛋白染色归一化。
三看实验处理。药物处理、低氧、诱导分化等条件会干扰管家基因表达，此时建议改用核蛋白内参（如 Lamin B1，针对核蛋白样本）或线粒体内参（VDAC/COX IV，针对线粒体组分）。
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